等度分離是指在洗脫過程中流動相組成不變的分離方法；而梯度分離是指在洗脫過程中流動相的組成隨運行過程而變化的分離方法。梯度分離可以通過逐漸增加強溶劑的濃度，從而兼顧樣品的分離度及保留時間。
6. 梯度洗脫中的基線問題更為普遍，并且必須使用高純?nèi)軇?/div>
梯度洗脫的應(yīng)用范圍
1. 樣品組分復(fù)雜，K值分布寬
2. 大分子樣品，尤其是生物樣品，如多肽的分離
3. 樣品中含有晚流出干擾物，它們會污染色譜柱或在后續(xù)的運行中流出
分離度的優(yōu)化
梯度洗脫方法的影響因素比較多，所以當(dāng)采用一種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行梯度試驗的時候，會因為使用的系統(tǒng)的不同或色譜柱的不同，而使得目標(biāo)峰的保留時間和分離效果有很大的差異
藥典方法，作為一種法定的方法，流動相的組成不能隨意變動。此時，實驗者可以調(diào)整的只有色譜柱的品牌和梯度比例或速率。一部分實驗者并不十分重視的色譜柱選擇，對于梯度方法是更為重要的。即使同樣的鍵合相，但生產(chǎn)廠家的不同或品牌的不同，其孔徑、比表面積等填料參數(shù)均有很大差異，對樣品的選擇性也會有很大的差異。從經(jīng)驗來說，選擇一只合適的色譜柱會更節(jié)約實驗中的人力和物力的消耗。您可以根據(jù)分離需要，咨詢色譜柱廠家，以獲得更專業(yè)的色譜柱推薦。確定色譜柱之后，如果需要對分離度進(jìn)行調(diào)整，首先應(yīng)該從保留時間較短的一對色譜峰的分離度開始調(diào)整，然后一對一對依次進(jìn)行調(diào)整。梯度方法和等度方法改善樣品分離度的方法和思路是一致的。
注意事項
1． 基線漂移
當(dāng)采用梯度洗脫時，流動相的純度不夠易導(dǎo)致基線明顯漂移。
2. 干擾峰
當(dāng)進(jìn)行空白梯度試驗時，尤其用短波長UV檢測和高靈敏度設(shè)置時，色譜圖中可能會出現(xiàn)很大的譜峰。這類干擾峰可能由流動相中含有的疏水性的并具有UV吸收的雜質(zhì)引起，如水、有機溶劑或流動相添加劑。出現(xiàn)這樣的狀況可通過簡單的實驗查出污染源。
查找污染源的*步是先用水相平衡柱30min，然后進(jìn)行一次空白梯度。然后平衡5min后重復(fù)空白梯度。如*次運行的干擾峰大得多，可能是水污染。如兩次空白運行無差異，有機溶劑的問題可能較大。流動相添加劑的可能污染可通過重復(fù)不哈添加劑的空白梯度來檢測。當(dāng)鑒別出流動相溶劑或組分被污染后，必須用干凈的試劑代替原試劑。
另外，如果梯度條件設(shè)置錯誤也容易導(dǎo)致干擾峰的出現(xiàn)。如線性梯度被設(shè)置為臺階梯度
4. 色譜峰保留不重復(fù)
由于實際樣品可能含有的強保留的雜質(zhì)。如果梯度的zui終流動相組成僅為洗脫目標(biāo)組分，則強保留的雜質(zhì)可能會在色譜柱上發(fā)生聚集，因而會改變柱效和保留值。所以建議在梯度洗脫末尾時，保持強洗脫溶劑一段時間，以便清洗色譜柱，保證更好的重復(fù)性。
梯度洗脫中，在一次進(jìn)樣結(jié)束后，應(yīng)該用初始流動相平衡色譜柱一段時間后，再進(jìn)行下一次實驗。如果不能*平衡柱子，色譜圖中的早期譜峰的保留值和分離效果會發(fā)生改變。柱平衡一般需要5~10倍柱體積的初始流動相（如4.6×150mm的色譜柱為7~15ml）。然而，這一平衡體積也會隨流動相和樣品而異，需要試驗人員對平衡體積進(jìn)行試驗。
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更新時間：2011-04-14 
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